Por Mauricio Quimbaya
La célula es la unidad estructural de todos los sistemas vivos. Como unidad es plenamente funcional, pero a la vez, cada célula se interconecta con cientos o miles de células más para formar niveles de organización más complejos como los tejidos o los órganos. En organismos pluricelulares como nosotros, cada célula posee una central de información que coordina todos los procesos fundamentales para su supervivencia. Esta central es el núcleo, el cual contiene el ADN, molécula que codifica las distintas instrucciones para la producción de proteínas. A su vez, en nosotros, las proteínas son los motores celulares que llevan a cabo los diferentes procesos que permiten el funcionamiento celular. El sostenimiento, la comunicación, el transporte de moléculas, la división celular y los procesos para obtener energía dependen de proteínas. Sin embargo, entre el código genético y los motores que cumplen las distintas funciones celulares existe un intermediario, el ARN, el cual interpreta el código permitiendo el ensamble de las proteínas. La ciencia ha estudiado los ácidos nucleicos (ADN y ARN) con el fin de entender de una mejor manera el funcionamiento celular.
Múltiples preguntas de investigación se fundamentan en diferentes tipos de análisis que usan como materia prima ácidos nucleicos, bien sea ADN o ARN. Si queremos saber la secuencia de un gen específico, o caracterizar algún tipo de marcador molecular, explorar una muestra de ADN en un caso forense, o si queremos amplificar una región específica del genoma, es necesario como primer paso obtener del tejido blanco cierta cantidad de ADN, cantidad que puede ser poca o mucha (hablando en un contexto experimental) dependiendo del procedimiento que queramos desarrollar. De la misma manera, si deseamos cuantificar los niveles de expresión génica que sustentan un proceso celular, es fundamental obtener como materia prima ARN. En un proceso típico de extracción de ácidos nucleicos utilizamos miles de células provenientes del tejido fuente que aportan su genoma o transcriptoma completo en dicho proceso de extracción, por lo tanto, los resultados obtenidos se basarán en un consenso global derivado de la sumatoria de eventos moleculares acaecidos en un momento específico en las células dadoras del ADN o del ARN. En la mayoría de casos dichos resultados globales son pertinentes para dar respuesta a una pregunta de investigación específica, es más, el análisis global es necesario para acceder a la variación biológica típica de los tejidos que se están analizando. Sin embargo, existen preguntas que solo pueden ser respondidas en base a la respuesta única y singular que una célula aislada produce en un instante particular.
En el presente escrito abordaré un par de ejemplos que permitirán ilustrar el tipo de preguntas o hipótesis de investigación que pueden ser contestadas o postuladas mediante la aplicación de métodos que utilizan los ácidos nucleicos extraídos de una única célula o de un número reducido de éstas. Esto en contraste a los protocolos tradicionales de extracción, en donde cientos o miles de células son las que aportan sus ácidos nucleicos para análisis posteriores.
Análisis de célula única en procesos ontogenéticos
La variabilidad en procesos de transcripción activa de genes, entre células morfológica y funcionalmente idénticas pertenecientes a un mismo tejido (isogénicas), fue descrita en primera instancia para células que expresan la enzima β-galactosidasa en respuesta a la presencia de lactosa (Novick & Weiner, 1957). Desde entonces se ha demostrado que la heterogeneidad transcripcional en células isogénicas gobierna un gran número de procesos fisiológicos que permiten la supervivencia celular (Lidstrom & Konopka, 2010; Martins & Locke, 2015). Sin embargo, la importancia de la expresión diferencial de genes que controlan procesos particulares de diferenciación celular, cobra una especial preponderancia durante el desarrollo embrionario. En el contexto del desarrollo ontogénico de organismos pluricelulares, capas muy finas de grupos de células determinan el futuro del desarrollo embrionario en un momento determinado, es así cuando por ejemplo en la formación del blastocele (primera cavidad que se forma durante el desarrollo del embrión) existe un grupo de células que mueren de una manera programada en un proceso celular conocido como apoptosis. Dicho proceso de muerte celular solo ocurre en el manojo de células específicas que formarán el blastocele, ni una célula más, ni una célula menos muere (Guo et al., 2017; Mohammed et al., 2017). El poder determinar, cuáles son los procesos celulares que son exclusivos de este grupo de células y que ocurren en éstas de una manera diferencial en relación al resto de células embrionarias, permitiría entender los patrones de desarrollo que rigen la evolución ontogenética en organismos superiores. Para poder postular hipótesis en relación a los procesos moleculares acaecidos durante la etapa particular de formación del blastocele es necesario ejecutar análisis de célula única.
Heterogeneidad tumoral
Durante muchos años, el santo grial de la lucha contra el cáncer se ha fundamentado en elucidar genes puntuales que expliquen, por lo menos en una alta proporción, el origen o progreso del proceso carcinogénico. Los genes cuyas mutaciones conducen a su alteración funcional dentro del contexto celular, dando origen o induciendo el avance de la carcinogénesis gracias su potencial regulador, se conocen como oncogenes, y las mutaciones en ellos presentes, se denominan mutaciones promotoras o conductoras (del inglés driver mutation). La presencia y caracterización de este tipo de genes y de la alta frecuencia de mutaciones específicas dentro de éstos es consecuencia de un modelo de progresión tumoral particular. En este modelo, existe una célula progenitora que sufre una o unas cuantas mutaciones que la hacen sobrevivir o escapar del control proliferativo celular. Esta célula hereda a su descendencia estas mutaciones, que a su vez, le darán a sus células hijas ventajas proliferativas y adaptativas al nicho tumoral. Si estas mutaciones son lo suficientemente ventajosas para el avance del proceso carcinogénico, al final del proceso de expansión, tendremos un gran número de células malignizadas que comparten mutaciones específicas sobre genes particulares, es decir, tendremos un tumor, o un grupo de células libres en plasma que comparten configuraciones genéticas similares debido a una amplificación lineal de las mutaciones fundadoras. Algunos tipos de cáncer se comportan de este modo como el mieloma múltiple (Bolli et al., 2014), o la leucemia mieloide aguda (Walter et al., 2012).
Según varios estudios de la última década, este comportamiento de amplificación clonal lineal es infrecuente, por el contrario, existe un modelo de progresión en el cual distintas células tumorales adquieren mutaciones diferentes en genes diferentes. Estas distintas mutaciones son heredadas a las siguientes generaciones de células creando subgrupos de células, clones diferenciados, con patrones mutacionales distintos entre sí, originando un mosaico tumoral conocido como heterogeneidad tumoral (Hiley, de Bruin, McGranahan, & Swanton, 2014; Mroz & Rocco, 2017). En algunos casos, tal heterogeneidad tumoral es tan marcada que tres células adyacentes pueden tener mutaciones radicalmente diferentes en genes distintos, pero con el mismo potencial inductor de la carcinogénesis. ¿Cómo hemos logrado caracterizar tales diferencias a un nivel de detalle tan fino? La respuesta se basa en técnicas de análisis genómicos de célula única, en donde un tejido tumoral es disgregado en sus células constitutivas mediante métodos de microdisección. En este procedimiento se obtienen células individualizadas y su DNA es aislado y analizado posteriormente, permitiendo comparar al final del procedimiento, genomas individuales de células pertenecientes al mismo tumor.
Pasos para obtener ácidos nucleicos de células únicas
Una célula humana contiene en promedio 7 picogramos de ADN (es decir siete millonesimas de millonesima de gramo) y una cantidad menor de ARN. En general, para procedimientos de secuenciación de genoma completo, o análisis globales de expresión de ARN es necesario al menos 1 microgramo de ácidos nucleicos (es decir una millonesima de gramo) lo que representa una cifra seis órdenes de magnitud mayor a lo que se puede obtener a partir de una única célula. Entonces, ¿cómo obtener la cantidad de materia prima necesaria para realizar los análisis necesarios?
A continuación, se expondrá de una manera muy breve los pasos necesarios para realizar un procedimiento específico de secuenciación o análisis transcripcional a partir del material genético de una única célula.
En los años venideros se continuarán perfeccionando las técnicas asociadas a los análisis de células únicas. Los experimentos enfocados en células únicas son tan útiles que se espera que la edición de genomas, utilizando CRISPR/Cas, pueda ser aplicada en el contexto de célula única. De la misma manera, las bases de datos y las aplicaciones bioinformáticas asociadas al análisis de resultados de este tipo de técnicas se han incrementado drásticamente indicando la relevancia biológica de éstos análisis experimentales (Ning et al., 2014).
Referencias
Bolli, N., Avet-Loiseau, H., Wedge, D. C., Van Loo, P., Alexandrov, L. B., Martincorena, I., . . . Munshi, N. C. (2014). Heterogeneity of genomic evolution and mutational profiles in multiple myeloma. Nat Commun, 5, 2997. doi:10.1038/ncomms3997
Guo, F., Li, L., Li, J., Wu, X., Hu, B., Zhu, P., . . . Tang, F. (2017). Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells. Cell Res, 27(8), 967-988. doi:10.1038/cr.2017.82
Hiley, C., de Bruin, E. C., McGranahan, N., & Swanton, C. (2014). Deciphering intratumor heterogeneity and temporal acquisition of driver events to refine precision medicine. Genome Biol, 15(8), 453. doi:10.1186/s13059-014-0453-8
Lidstrom, M. E., & Konopka, M. C. (2010). The role of physiological heterogeneity in microbial population behavior. Nat Chem Biol, 6(10), 705-712. doi:10.1038/nchembio.436
Macaulay, I. C., & Voet, T. (2014). Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS Genet, 10(1), e1004126. doi:10.1371/journal.pgen.1004126
Martins, B. M., & Locke, J. C. (2015). Microbial individuality: how single-cell heterogeneity enables population level strategies. Curr Opin Microbiol, 24, 104-112. doi:10.1016/j.mib.2015.01.003
Mohammed, H., Hernando-Herraez, I., Savino, A., Scialdone, A., Macaulay, I., Mulas, C., . . . Reik, W. (2017). Single-Cell Landscape of Transcriptional Heterogeneity and Cell Fate Decisions during Mouse Early Gastrulation. Cell Rep, 20(5), 1215-1228. doi:10.1016/j.celrep.2017.07.009
Mroz, E. A., & Rocco, J. W. (2017). The challenges of tumor genetic diversity. Cancer, 123(6), 917-927. doi:10.1002/cncr.30430
Ning, L., Liu, G., Li, G., Hou, Y., Tong, Y., & He, J. (2014). Current challenges in the bioinformatics of single cell genomics. Front Oncol, 4, 7. doi:10.3389/fonc.2014.00007
Novick, A., & Weiner, M. (1957). ENZYME INDUCTION AS AN ALL-OR-NONE PHENOMENON. Proc Natl Acad Sci U S A, 43(7), 553-566.
Walter, M. J., Shen, D., Ding, L., Shao, J., Koboldt, D. C., Chen, K., . . . Graubert, T. A. (2012). Clonal architecture of secondary acute myeloid leukemia. N Engl J Med, 366(12), 1090-1098. doi:10.1056/NEJMoa1106968
Wang, Y., & Navin, N. E. (2015). Advances and applications of single-cell sequencing technologies. Mol Cell, 58(4), 598-609. doi:10.1016/j.molcel.2015.05.005
La célula es la unidad estructural de todos los sistemas vivos. Como unidad es plenamente funcional, pero a la vez, cada célula se interconecta con cientos o miles de células más para formar niveles de organización más complejos como los tejidos o los órganos. En organismos pluricelulares como nosotros, cada célula posee una central de información que coordina todos los procesos fundamentales para su supervivencia. Esta central es el núcleo, el cual contiene el ADN, molécula que codifica las distintas instrucciones para la producción de proteínas. A su vez, en nosotros, las proteínas son los motores celulares que llevan a cabo los diferentes procesos que permiten el funcionamiento celular. El sostenimiento, la comunicación, el transporte de moléculas, la división celular y los procesos para obtener energía dependen de proteínas. Sin embargo, entre el código genético y los motores que cumplen las distintas funciones celulares existe un intermediario, el ARN, el cual interpreta el código permitiendo el ensamble de las proteínas. La ciencia ha estudiado los ácidos nucleicos (ADN y ARN) con el fin de entender de una mejor manera el funcionamiento celular.
Múltiples preguntas de investigación se fundamentan en diferentes tipos de análisis que usan como materia prima ácidos nucleicos, bien sea ADN o ARN. Si queremos saber la secuencia de un gen específico, o caracterizar algún tipo de marcador molecular, explorar una muestra de ADN en un caso forense, o si queremos amplificar una región específica del genoma, es necesario como primer paso obtener del tejido blanco cierta cantidad de ADN, cantidad que puede ser poca o mucha (hablando en un contexto experimental) dependiendo del procedimiento que queramos desarrollar. De la misma manera, si deseamos cuantificar los niveles de expresión génica que sustentan un proceso celular, es fundamental obtener como materia prima ARN. En un proceso típico de extracción de ácidos nucleicos utilizamos miles de células provenientes del tejido fuente que aportan su genoma o transcriptoma completo en dicho proceso de extracción, por lo tanto, los resultados obtenidos se basarán en un consenso global derivado de la sumatoria de eventos moleculares acaecidos en un momento específico en las células dadoras del ADN o del ARN. En la mayoría de casos dichos resultados globales son pertinentes para dar respuesta a una pregunta de investigación específica, es más, el análisis global es necesario para acceder a la variación biológica típica de los tejidos que se están analizando. Sin embargo, existen preguntas que solo pueden ser respondidas en base a la respuesta única y singular que una célula aislada produce en un instante particular.
En el presente escrito abordaré un par de ejemplos que permitirán ilustrar el tipo de preguntas o hipótesis de investigación que pueden ser contestadas o postuladas mediante la aplicación de métodos que utilizan los ácidos nucleicos extraídos de una única célula o de un número reducido de éstas. Esto en contraste a los protocolos tradicionales de extracción, en donde cientos o miles de células son las que aportan sus ácidos nucleicos para análisis posteriores.
Análisis de célula única en procesos ontogenéticos
La variabilidad en procesos de transcripción activa de genes, entre células morfológica y funcionalmente idénticas pertenecientes a un mismo tejido (isogénicas), fue descrita en primera instancia para células que expresan la enzima β-galactosidasa en respuesta a la presencia de lactosa (Novick & Weiner, 1957). Desde entonces se ha demostrado que la heterogeneidad transcripcional en células isogénicas gobierna un gran número de procesos fisiológicos que permiten la supervivencia celular (Lidstrom & Konopka, 2010; Martins & Locke, 2015). Sin embargo, la importancia de la expresión diferencial de genes que controlan procesos particulares de diferenciación celular, cobra una especial preponderancia durante el desarrollo embrionario. En el contexto del desarrollo ontogénico de organismos pluricelulares, capas muy finas de grupos de células determinan el futuro del desarrollo embrionario en un momento determinado, es así cuando por ejemplo en la formación del blastocele (primera cavidad que se forma durante el desarrollo del embrión) existe un grupo de células que mueren de una manera programada en un proceso celular conocido como apoptosis. Dicho proceso de muerte celular solo ocurre en el manojo de células específicas que formarán el blastocele, ni una célula más, ni una célula menos muere (Guo et al., 2017; Mohammed et al., 2017). El poder determinar, cuáles son los procesos celulares que son exclusivos de este grupo de células y que ocurren en éstas de una manera diferencial en relación al resto de células embrionarias, permitiría entender los patrones de desarrollo que rigen la evolución ontogenética en organismos superiores. Para poder postular hipótesis en relación a los procesos moleculares acaecidos durante la etapa particular de formación del blastocele es necesario ejecutar análisis de célula única.
Heterogeneidad tumoral
Durante muchos años, el santo grial de la lucha contra el cáncer se ha fundamentado en elucidar genes puntuales que expliquen, por lo menos en una alta proporción, el origen o progreso del proceso carcinogénico. Los genes cuyas mutaciones conducen a su alteración funcional dentro del contexto celular, dando origen o induciendo el avance de la carcinogénesis gracias su potencial regulador, se conocen como oncogenes, y las mutaciones en ellos presentes, se denominan mutaciones promotoras o conductoras (del inglés driver mutation). La presencia y caracterización de este tipo de genes y de la alta frecuencia de mutaciones específicas dentro de éstos es consecuencia de un modelo de progresión tumoral particular. En este modelo, existe una célula progenitora que sufre una o unas cuantas mutaciones que la hacen sobrevivir o escapar del control proliferativo celular. Esta célula hereda a su descendencia estas mutaciones, que a su vez, le darán a sus células hijas ventajas proliferativas y adaptativas al nicho tumoral. Si estas mutaciones son lo suficientemente ventajosas para el avance del proceso carcinogénico, al final del proceso de expansión, tendremos un gran número de células malignizadas que comparten mutaciones específicas sobre genes particulares, es decir, tendremos un tumor, o un grupo de células libres en plasma que comparten configuraciones genéticas similares debido a una amplificación lineal de las mutaciones fundadoras. Algunos tipos de cáncer se comportan de este modo como el mieloma múltiple (Bolli et al., 2014), o la leucemia mieloide aguda (Walter et al., 2012).
Según varios estudios de la última década, este comportamiento de amplificación clonal lineal es infrecuente, por el contrario, existe un modelo de progresión en el cual distintas células tumorales adquieren mutaciones diferentes en genes diferentes. Estas distintas mutaciones son heredadas a las siguientes generaciones de células creando subgrupos de células, clones diferenciados, con patrones mutacionales distintos entre sí, originando un mosaico tumoral conocido como heterogeneidad tumoral (Hiley, de Bruin, McGranahan, & Swanton, 2014; Mroz & Rocco, 2017). En algunos casos, tal heterogeneidad tumoral es tan marcada que tres células adyacentes pueden tener mutaciones radicalmente diferentes en genes distintos, pero con el mismo potencial inductor de la carcinogénesis. ¿Cómo hemos logrado caracterizar tales diferencias a un nivel de detalle tan fino? La respuesta se basa en técnicas de análisis genómicos de célula única, en donde un tejido tumoral es disgregado en sus células constitutivas mediante métodos de microdisección. En este procedimiento se obtienen células individualizadas y su DNA es aislado y analizado posteriormente, permitiendo comparar al final del procedimiento, genomas individuales de células pertenecientes al mismo tumor.
Pasos para obtener ácidos nucleicos de células únicas
Una célula humana contiene en promedio 7 picogramos de ADN (es decir siete millonesimas de millonesima de gramo) y una cantidad menor de ARN. En general, para procedimientos de secuenciación de genoma completo, o análisis globales de expresión de ARN es necesario al menos 1 microgramo de ácidos nucleicos (es decir una millonesima de gramo) lo que representa una cifra seis órdenes de magnitud mayor a lo que se puede obtener a partir de una única célula. Entonces, ¿cómo obtener la cantidad de materia prima necesaria para realizar los análisis necesarios?
A continuación, se expondrá de una manera muy breve los pasos necesarios para realizar un procedimiento específico de secuenciación o análisis transcripcional a partir del material genético de una única célula.
- Como primera medida las células blanco a ser caracterizadas se deben individualizar. Para esto, como ya se había mencionado, se puede realizar un proceso de microdisección realizada por robots bajo condiciones de cultivo que permiten la separación e individualización de células. Alternativamente, existe un método conocido como FACS o separación diferencial de células por fluorescencia (del inglés Fluorescence activated Cell Sorting of Live Cells) en el cual, las células de interés son identificadas mediante anticuerpos fluorescentes que identifican proteínas de membrana exclusivas de las células de interés. El sorteador de células no solamente identifica la fluorescencia de las células marcadas, sino que también, está en la capacidad de separarlas del resto de células y depositarlas en recipientes individuales que las mantienen vivas y viables (Macaulay & Voet, 2014).
- Como segundo paso, los ácidos nucleicos deben ser extraídos y amplificados. Existen múltiples métodos que permiten ambos procesos. En general, las técnicas de amplificación lineal de ácidos nucleicos se fundamentan en ligamiento y amplificación diferencial de adaptadores por PCR o por técnicas derivadas de ésta. El objetivo es realizar una amplificación masiva de la información genética contenida en la célula sin inducir variantes o sin modificar las proporciones de ARN presentes en éstas. Este es el paso decisivo pues cualquier alteración o cambio a consecuencia del proceso de amplificación incidirá directamente en los resultados obtenidos y por ende en las conclusiones alcanzadas por el estudio (Wang & Navin, 2015).
- Finalmente los ácidos nucleicos amplificados son sometidos a procedimientos asociados a técnicas de secuenciación de próxima generación (del inglés Next Generation Sequencing), lo cual permite tener una perspectiva holística en relación a los genes que estaban siendo expresados en la célula analizada en el momento de realizar la extracción de sus ácidos nucleicos.
En los años venideros se continuarán perfeccionando las técnicas asociadas a los análisis de células únicas. Los experimentos enfocados en células únicas son tan útiles que se espera que la edición de genomas, utilizando CRISPR/Cas, pueda ser aplicada en el contexto de célula única. De la misma manera, las bases de datos y las aplicaciones bioinformáticas asociadas al análisis de resultados de este tipo de técnicas se han incrementado drásticamente indicando la relevancia biológica de éstos análisis experimentales (Ning et al., 2014).
Referencias
Bolli, N., Avet-Loiseau, H., Wedge, D. C., Van Loo, P., Alexandrov, L. B., Martincorena, I., . . . Munshi, N. C. (2014). Heterogeneity of genomic evolution and mutational profiles in multiple myeloma. Nat Commun, 5, 2997. doi:10.1038/ncomms3997
Guo, F., Li, L., Li, J., Wu, X., Hu, B., Zhu, P., . . . Tang, F. (2017). Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells. Cell Res, 27(8), 967-988. doi:10.1038/cr.2017.82
Hiley, C., de Bruin, E. C., McGranahan, N., & Swanton, C. (2014). Deciphering intratumor heterogeneity and temporal acquisition of driver events to refine precision medicine. Genome Biol, 15(8), 453. doi:10.1186/s13059-014-0453-8
Lidstrom, M. E., & Konopka, M. C. (2010). The role of physiological heterogeneity in microbial population behavior. Nat Chem Biol, 6(10), 705-712. doi:10.1038/nchembio.436
Macaulay, I. C., & Voet, T. (2014). Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS Genet, 10(1), e1004126. doi:10.1371/journal.pgen.1004126
Martins, B. M., & Locke, J. C. (2015). Microbial individuality: how single-cell heterogeneity enables population level strategies. Curr Opin Microbiol, 24, 104-112. doi:10.1016/j.mib.2015.01.003
Mohammed, H., Hernando-Herraez, I., Savino, A., Scialdone, A., Macaulay, I., Mulas, C., . . . Reik, W. (2017). Single-Cell Landscape of Transcriptional Heterogeneity and Cell Fate Decisions during Mouse Early Gastrulation. Cell Rep, 20(5), 1215-1228. doi:10.1016/j.celrep.2017.07.009
Mroz, E. A., & Rocco, J. W. (2017). The challenges of tumor genetic diversity. Cancer, 123(6), 917-927. doi:10.1002/cncr.30430
Ning, L., Liu, G., Li, G., Hou, Y., Tong, Y., & He, J. (2014). Current challenges in the bioinformatics of single cell genomics. Front Oncol, 4, 7. doi:10.3389/fonc.2014.00007
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Walter, M. J., Shen, D., Ding, L., Shao, J., Koboldt, D. C., Chen, K., . . . Graubert, T. A. (2012). Clonal architecture of secondary acute myeloid leukemia. N Engl J Med, 366(12), 1090-1098. doi:10.1056/NEJMoa1106968
Wang, Y., & Navin, N. E. (2015). Advances and applications of single-cell sequencing technologies. Mol Cell, 58(4), 598-609. doi:10.1016/j.molcel.2015.05.005
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